為了對(duì)以個(gè)特定序列進(jìn)行PCR做重復(fù)檢測(cè)，需要三個(gè)不同的區(qū)域，每一個(gè)區(qū)域的具體技術(shù)操作和試劑在下面詳細(xì)列出。

　　1、樣品準(zhǔn)備區(qū)

　　這個(gè)區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準(zhǔn)備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應(yīng)該采取預(yù)防措施：

　　1)PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個(gè)房間操作。

　　2)組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。

　　3)用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。

　　4)DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時(shí)有氣溶膠遺留。

　　5)大體積樣品應(yīng)該用單獨(dú)包裝的無菌一次性移液管吸取。

　　6)管子打開前都要簡(jiǎn)短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開，這樣會(huì)產(chǎn)生氣溶膠。

　　7)任何時(shí)候都應(yīng)該穿實(shí)驗(yàn)服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實(shí)驗(yàn)服要專門用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗。

　　2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCR

　　RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機(jī)會(huì)。為了避免這一問題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報(bào)道。

　　3、前PCR區(qū)

　　必須有專門用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)的區(qū)域，這個(gè)區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。

　　4、PCR實(shí)驗(yàn)室試劑的操作

　　1)所用的所有溶液都應(yīng)該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。

　　2)所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的-新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。

　　3)在20℃到25℃貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴(kuò)增反應(yīng)。

　　4)所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實(shí)驗(yàn)一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。

　　5)所有試劑和樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。

　　6)新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗(yàn)。

　　7)樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時(shí)都應(yīng)該小心保存。

　　5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物

　　1)可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實(shí)驗(yàn)室只涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時(shí)這樣做很有用。

　　2)如果你的實(shí)驗(yàn)室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟(jì)，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。

　　3)作為一個(gè)規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽性和強(qiáng)陽性對(duì)照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個(gè)已知的弱陽性樣品來驗(yàn)證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴(kuò)增抑制物。

　　4)陰性樣品要與每組樣品同時(shí)做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對(duì)照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。

　　5)當(dāng)做陽性對(duì)照時(shí)，有兩個(gè)理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。

　　6)由于必須有對(duì)照反應(yīng)，對(duì)照模板的特點(diǎn)應(yīng)該予以考慮。

　　6、控制污染的方法

　　已設(shè)計(jì)出很有力的酶學(xué)方法用來消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。

　　7、PCR儀的位置

　　8、后PCR區(qū)

　　PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個(gè)專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動(dòng)中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實(shí)驗(yàn)室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動(dòng)。